Лечение генами.

Сегодня каждому известно, что генетическая информация, направляет и контролирует синтез РНК и

белков. Изменения генетического материала называются мутациями, и если мутации искажают

информацию, записанную в генах, или затрагивают регуляторные области, приводя к выключению

генов, то они являются причиной генетических заболеваний. Если подобные мутации происходят в

клетках зародышевого пути организмов, размножающихся половым путем, то они передаются по

наследству и заболевание становится наследственным.

В мире каждый сотый ребенок рождается с серьезным наследственным дефектом, и количество таких

дефектов неумолимо растет. Наследственные отклонения, как правило, приводят к физическим или

умственным нарушениям и преждевременной смерти. Для большинства наследственных заболеваний

не найдено достаточно эффективных способов лечения.

Спасением от наследственных заболеваний могло бы стать введение в организм больного

неповрежденной копии мутантного участка ДНК. Идея, еще недавно казавшаяся фантастической,

становится вполне реальной благодаря достижениям в области генетической инженерии. Эта

технология позволяет выделять индивидуальные гены и последовательности ДНК (клонировать

ДНК), а затем направленно изменять их в пробирке, создавая рекомбинантную ДНК - новые

сочетания последовательностей нуклеотидов. Молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие

неповрежденную копию мутантного участка ДНК и сконструированные таким образом, чтобы их

можно было ввести в клетки нового хозяина, смогут заменить поврежденный ген, направляя синтез

недостающего продукта, или же заставят работать имеющийся у хозяина, но выключенный ген.

Произойдет изменение генетического материала организма, или его генотипа, и как следствие -

исправление врожденной ошибки обмена веществ. Наследственное заболевание будет излечено при

помощи генотерапии.

МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА "ЛЕЧЕБНЫХ" ГЕНОВ

Метод генотерапии находится на ранней стадии развития. Первая успешная попытка применить

генотерапию в клинической практике была предпринята в 1990 году в США. Ребенку, страдающему

редким заболеванием - тяжелым комбинированным иммунодефицитом, - которое связано с дефектом

гена, кодирующего фермент аденозиндезаминазу, была введена неповрежденная копия гена. И хотя

использованный метод предполагал многократное введение гена на протяжении всей жизни

пациента, то есть, строго говоря, не обеспечивал полного излечения, была открыта новая эра в

медицине.

Существуют несколько подходов к лечению генами. Гены можно вводить в половые клетки

(сперматозоиды или яйцеклетки), в клетки эмбриона на ранних стадиях развития либо в

соматические клетки (клетки тела, кроме половых или их предшественников). Введение генов в

половые клетки означает, что приобретенное свойство будет передаваться из поколения в поколение.

Именно этот метод широко используется при получении трансгенных животных, но он вряд ли

применим к людям из этических соображений. Действительно, имеем ли мы право вмешиваться в

эволюцию человека? Оправдан ли риск внесения в генофонд изменений, ведь мы еще не знаем всей

сложной системы взаимодействия генов и их регуляции и, заменяя один "больной" ген, можем

нарушить работу других и тем самым вместо ожидавшейся пользы принести вред, а может быть, и

гибель человеку как виду. Генотерапия соматических клеток в отличие от половых затрагивает

организм только самого пациента и поэтому разрабатывается в качестве основного подхода. При этом

большое значение имеет правильный выбор типа соматических клеток, которые должны обеспечить

длительное сохранение и функционирование внесенного "лечебного" гена.

Наследственные заболевания могут быть обусловлены дефектом одного или нескольких генов, а

также крупными генетическими изменениями, например потерей целой хромосомы. Безусловно, на

современном этапе можно пытаться лечить генами только заболевания первого типа, так называемые

моногенные, при условии, если ответственный за дефект ген уже обнаружен и клонирован, то есть

получен материал для введения больному.

В принципе существуют два пути передачи больному "лечебного" гена. Если болезнь связана с

отсутствием или малыми количествами белкового продукта дефектного гена, то достаточно ввести в

клетку неповрежденный ген и дать ему возможность работать; в результате появятся достаточные

количества белка-продукта. Таким образом, внесенная копия гена заместит по функциям

сохраняющийся в геноме больного дефектный ген, поэтому этот подход получил название

заместительной терапии. Все используемые в настоящее время клинические методы переноса генов

основаны на внесении в клетку дополнительных количеств ДНК, то есть на заместительной терапии.

Другим, идеальным способом излечивать генетические заболевания могла бы быть корректирующая

(или исправляющая) терапия, при помощи которой дефектный ген реально заменялся бы в геноме

нормальной копией. Этого можно достичь основываясь на способности двух молекул ДНК к

рекомбинации - обмену при помощи специальных ферментов фрагментами полинуклеотидных

цепей. Однако из-за крайне низкой эффективности этого метода в условиях лаборатории до

практического использования корректирующей терапии пока очень далеко.

Генетическая модификация соматических клеток может производиться либо непосредственно в

организме больного, либо путем введения функционального гена в предварительно выделенные и

культивируемые клетки пациента, которые затем возвращают обратно в организм. Оба способа

имеют недостатки и ограничения, но в целом второй способ используется в настоящее время чаще

из-за своей большей эффективности. В табл. 1 перечислены разработанные методы введения ДНК в

животные клетки и указана их применимость для доставки генов в культуру клеток или

непосредственно в орган. Химический метод доставки состоит в том, что если к очищенной ДНК

добавить ионы Ca2 + или некоторые другие положительно заряженные соединения, то образующийся

осадок поглощается культивируемыми клетками. При этом лишь очень небольшая часть внесенной

ДНК проникает в ядра клеток, то есть эффективность переноса генов крайне низка. Метод

электропорации (создания микроскопических пор в мембранах клеток при помощи электрического

высоковольтного разряда) несколько более эффективен, однако при этом возможны серьезные

повреждения клеток. Оба описанных метода, равно как микроинъекция ДНК в отдельную клетку при

помощи тонких стеклянных пипеток, не применяются для генотерапии. В отличие от микроинъекции

обычная инъекция раствора ДНК шприцем и иглой может использоваться для переноса генов в

некоторые ткани организма (например, в мышцы). В последние годы предложены новые способы

доставки ДНК в соматические клетки, которые можно применять для лечения генами. Из физических

методов следует назвать бомбардировку частицами, когда ДНК наносится на микроскопические

металлические "дробинки" и выстреливается в клетку. Внесение ДНК в комплексе с липосомами -

искусственными мембранными пузырьками, приготовленными из липидов, которые сливаются с

плазматической мембраной клетки, - обеспечивает достаточно эффективный перенос в нее ДНК.

Предлагается также использовать комплексы ДНК с белками, для которых на поверхности клетки

имеются специфические рецепторы. После связывания рецептором белка чужеродная ДНК вместе с

белком будет поглощена клеткой-мишенью. Наконец, еще один подход использует природную

способность вирусов проникать в клетки и привносить в них собственный генетический материал. В

последнее время на основе генетического материала вирусов создано множество генноинженерных

конструкций, служащих векторами, то есть средствами доставки новых генов в клетки. Используют

ретровирусные (их особенности будут пояснены позже) и аденовирусные векторы, а также векторы

на основе некоторых других вирусов.

Главное в методе переноса генов - включается (интегрирует) ли новый ген в хромосому клетки-

мишени. Для активно делящихся клеток отсутствие интеграции внесенного гена в клеточную ДНК

означает его неминуемую утрату в клетках-потомках (рис. 1). Одной из основных причин того, что в

80% случаев для внесения чужеродной ДНК при клинических испытаниях на людях использовали

ретровирусные векторы, является его стабильная интеграция в клеточный геном. Кроме того, эти

векторы обеспечивают высокую эффективность доставки генов и не приводят к ощутимым

повреждениям в клетке-мишени. В отличие от ретровирусных аденовирусные векторы в геном не

интегрируются. Далее мы подробнее остановимся на строении ретровирусов и векторов на их

основе.

В начале статьи мы говорили о том, что генетическая информация записана в клетке в форме ДНК.

На матрице ДНК синтезируются разные типы молекул РНК, один из которых (информационная, или

матричная, РНК) направляет синтез белков. Это фундаментальное положение, сформулированное на

заре молекулярной биологии, получило название основной догмы молекулярной биологии (рис. 2). В

своей первоначальной форме основная догма гласила, что в природе возможны синтез РНК на ДНК и

синтез белка под контролем РНК, но ни в коем случае не в обратном направлении. Однако в 1970

году было установлено, что онкогенные, то есть вызывающие рак, РНК-содержащие вирусы

животных (а все вирусы можно разделить на две большие группы в зависимости от того, какую

нуклеиновую кислоту - ДНК или РНК - они содержат в качестве генетического материала) способны

синтезировать ДНК на своей РНК как на матрице. Этот процесс получил название "обратной

транскрипции" в отличие от прямой транскрипции ДНК РНК, а осуществляющие его вирусы,

которые принципиально отличаются от остальных живых организмов по типу превращения генома,

стали называть ретровирусами (от лат. retro - обратно, назад).

На рис. 3 схематически представлены строение частиц ретровируса (слева вверху) и его жизненный

цикл. Сердцевина вируса, построенная из специальных вирусных белков, содержит две идентичные

молекулы одноцепочечной РНК, а также немногочисленные молекулы вирусных ферментов.

Сердцевина окружена оболочкой, собранной из клеточных мембран хозяина с вкраплениями еще

одного вирусного белка. Последний обеспечивает прикрепление вируса к поверхности клетки. Вслед

за этим происходят "раздевание" РНК и ее проникновение вместе с белками сердцевины вируса в

клетку, где специальный вирусный фермент катализирует обратную транскрипцию РНК в ДНК.

Двухцепочечная вирусная ДНК перемещается в клеточное ядро и встраивается в хромосому. Это

свойство ретровируса обеспечивает стабильное сохранение его генетической информации:

реплицируясь вместе с клеточной ДНК при делении клетки, вирусспецифическая ДНК (провирус)

передается в дочерние клетки. Провирус направляет синтез вирусных белков и РНК, которые затем

собираются в частицы и выходят из клетки, отпочковываясь от клеточной мембраны. Еще одним

уникальным свойством ретровирусов является то, что в составе их генома могут присутствовать

последовательности нуклеотидов, которые отличаются от собственных генов вируса и, как оказалось,

захвачены из ДНК клетки-хозяина. Таким образом, для ретровирусов характерна передача

генетической информации в направлении РНК ДНК РНК, и они являются природными

генетическими векторами. Теперь ясно, почему на их основе удобно создавать искусственные

векторы для переноса генов.

Действительно, если лишить ретровирус генетического материала, кодирующего вирусные белки, то

это приведет, как показано на рис. 3, к невозможности давать потомство новых вирусных частиц. На

освободившееся в геноме вируса место можно ввести чужеродный ген и таким образом создать

ретровирусный вектор. А вот размножаться такой дефектный вирус сможет только в присутствии

другого вируса-помощника с неизмененной РНК, чьи белки будут "приватизированы" нашим

вектором. Именно так на основе вируса лейкоза мышей сконструированы векторы, которые

обеспечивают высокоэффективный перенос генов и их стабильное встраивание в хромосому клеток-

мишеней. А если уж вектор встроился в клеточную ДНК, то он будет передаваться при нормальном

делении всему потомству этой клетки. Это свойство чрезвычайно важно для стойкого исправления

генетического дефекта. Несмотря на очевидные достоинства ретровирусных векторов, их

возможности далеко не безграничны. Так, ретровирусная ДНК может встраиваться в хромосомную

ДНК только тех клеток, которые способны к активному делению. Другим серьезным недостатком

ретровирусных векторов является то, что они встраиваются в геном клеток хозяина беспорядочно, то

есть в каждой клетке включение происходит в разные участки любой из хромосом. Это создает

проблемы, из которых отметим одну - теоретическую возможность злокачественного перерождения

отдельных клеток хозяина из-за повреждения их генетического материала при встраивании вектора.

Тем не менее, как уже указывалось, достоинства ретровирусных векторов делают их основной

системой доставки генов при клинических испытаниях.

Учённые бьют тревогу над решением проблемы лечения генами "чумы ХХ века" - синдрома

приобретенного иммунодефицита (СПИД), возникающего при заражении вирусом иммунодефицита

человека (ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги.

Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные

ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса. Предложено множество

хитроумных способов борьбы со СПИДом с помощью привнесенных генов. Все они основаны на

новейших данных о строении и функционировании генома ретровируса. Например, вводя прямо в

мышцы больного ретровирусные векторы, несущие отдельные гены ВИЧ, ученые рассчитывали на

то, что гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом хозяина смогут дать информацию для синтеза

вирусных белков и произойдет "противоСПИДная" иммунизация больного этими белками. Однако

еще не получено ощутимых результатов, которые сулили бы успех в борьбе с вирусом дикого типа,

коварство которого заключается в его изменчивости.

Огромные перспективы открывает использование генотерапии для лечения онкологических

заболеваний. Многолетние усилия ученых привели к пониманию того, что рак - это генетическое

заболевание и его развитие происходит многостадийно, в результате серии генетических нарушений,

накапливающихся в клетке. Следовательно, каждый из таких отдельных генетических дефектов

может стать точкой приложения генотерапевтического подхода. Сейчас, когда усилия многих

лабораторий направлены на поиски путей генотерапии отдельных форм рака, некоторые из этих

возможностей прорабатываются в лабораториях и клиниках. К сожалению, рамки статьи не

позволяют подробнее остановиться на рассмотрении успехов, достигнутых в области генотерапии

опухолей головного мозга, груди, языка, злокачественной меланомы и других форм рака.

В перспективе генотерапия даёт обществу большую возможность в избавлении от не излечимых

болезней.